|
生物芯片的异军突起 生物芯片技术是近几年发展起来的，广泛应用于基因序列分析、杂交、基因突变检测及多态性分析、基因组文库图型分析以及疾病的基因诊断等领域的一项新技术。该技术同时将大量不同的探针固定于同一支持物上，因而可以一次性对同一样品进行大量序列检测和核酸分析。它的技术核心是生物芯片的制备及反应信号的检测。
所谓生物芯片是由固定于不同种类支持介质上的高密度的寡核苷酸分子、基因片段或多肽分子的微阵列组成，其中每个分子的位置及序列为已知，当荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子结合后，可通过激光共聚焦荧光扫描或电荷偶联摄影像机(CCD)对荧光信号的强度进行检测，从而对杂交结果进行量化分析。制备芯片的固相介质有玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等。在选择固相介质时，应考虑其荧光背景的大小、化学稳定性、结构复杂性、介质对化学修饰作用的反应，介质表面积及其承载能力以及非特异吸附的程度等因素。目前较为常用的支持介质是玻片，无论是原位合成法还是合成点样法都可以使用玻片，作其固相介质，而且在制备芯片前对该介质的预处理也相对简单易行。芯片制备的方法主要有原位合成与合成点样。其中原位合成又可分为光引导聚合法和喷墨打印合成法(压电打印法)。光引导聚合法在合成前需先对介质进行处理，使之衍生出羟基或氨基并与光敏保护基建立共价连接，合成单体的一端用固相合成法活化，另一端与光敏保护基相连。在合成反应过程中，通过蔽光膜使特定的位点透光，其余位点不透光，只有受光的位点才能脱掉保护基并与特定单体活化端相连，单体的光敏保护端露出，经过若干上述循环反应后，使每个位点按需要合成特定序列的探针，其中每次合成反应中哪些位点上连接哪种单体，由更换不同的蔽光膜来控制。喷墨打印合成法的原理类似于喷墨打印机，通过4个喷印头将4种碱基按序列要求依次喷印在芯片的特定位点上。合成点样法是指将预先合成好的探针用点样机点到介质上，点样前需将介质表面包被氨基硅烷或多聚赖氨酸，使之带上正电荷来吸附核酸分子。
杂交反应是一个复杂的过程，受很多因素的影响，而杂交反应的质量和效率直接关系到检测结果的准确性。这些影响因素包括:(1)寡核苷酸探针密度的影响。低覆盖率使杂交信号减弱，而过高的覆盖率会造成相邻探针之间的杂交干扰。(2)支持介质与杂交序列间的间隔序列长度的影响。研究表明当间隔序列长度提高到15个寡核苷酸时杂交信号显著增强。有研究表明，选择合适长度的间隔序列，可使杂交信号增强150倍。(3)杂交序列长度的影响。在杂交反应中经常发生碱基错配现象，区分正常配对的互补复合物与单个或2个碱基的错配形成的复合物，主要依赖于形成的复合物的稳定性不同，而杂交序列的长度是影响复合物稳定性的一个重要因素，一般说来，短的杂交序列更容易区分碱基的错配，但复合物的稳定性要差一些;而长杂交序列形成的复合物稳定，而区分碱基错配能力要差一些。研究表明，12、15、20个碱基产生的杂交信号强度接近，但15个碱基的杂交序列区分错配碱基效果最好。(4)GC含量的影响。GC含量不同的序列其复合物的稳定性也不同。(5)探针浓度的影响。以凝胶为支持介质的芯片，提高了寡核苷酸的浓度，在胶内进行的杂交更象在液相中进行的杂交反应，这些因素提高了对错配碱基的分辨率，同时也提高了芯片检测的灵敏度。(6)核酸二级结构的影响。在使用凝胶作为支持介质时，单链核酸越长，则样品进入凝胶单元的时间越长，也就越容易形成链内二级结构从而影响其与芯片上探针的杂交，因而样品制备过程中，对核酸的片段化处理，不仅可提高杂交信号的强度，还可提高杂交速度。
生物芯片的两个关键技术是芯片的制备与结果检测。目前荧光检测主要有2种:激光共聚焦荧光显微扫描和CCD荧光显微照相检测。前者检测灵敏度、分辨率均较高，但扫描时间长;后者扫描时间短，但灵敏度和分辨率不如前者。虽然荧光检测在芯片技术中得到了广泛的应用，但是荧光标记的靶DNA只要结合到芯片上就会产生荧光信号，而目前的检测系统还不能区分来自某一位点的荧光信号是由正常配对产生的，还是单个或2个碱基的错配产生的，或者兼而有之，甚或是由非特异性吸附产生的，因而目前的荧光检测系统还有待于进一步完善与发展。有研究者正试图绕过荧光标记，建立新的检测系统，以提高杂交信号检测的灵敏度。以上技术的应用和发展，使人类基因组计划的研究工作得到了很大的提高。随着DNA芯片的发展，芯片技术在基因表达的监测及疾病诊断的研究中正在得到广泛应用。 |
